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營養與健康所發現RIPK3蛋白RHIM結構域調控細胞死亡和炎癥的新機制

2020-05-22 上海營養與健康研究所
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  5月19日,國際學術期刊Cell Reports 在線發表了中國科學院上海營養與健康研究所章海兵課題組的研究論文“Crucial roles of the RIP homotypic interaction motifs (RHIM) of RIPK3 in RIPK1-dependent cell death and lymphoproliferative disease”。該研究發現小鼠RIPK3蛋白V448P突變破壞C端RHIM結構域導致RIPK1-RIPK3相互作用缺失從而抑制體外、體內細胞程序性壞死(necroptosis)的發生;同時在FADD敲除小鼠中RHIM結構域的V448P突變還導致嚴重的全身系統性淋巴增生特征的自身免疫性疾?。⊿ystemic lymphoproliferative disease),而進一步敲除RIPK1基因可以緩解系統性的淋巴細胞增生的發生。

  細胞程序性壞死是一種新型的細胞炎性死亡方式,以胞質內蛋白形成壞死小體(necrosome),細胞膜打孔破裂釋放內容物誘導炎癥為主要特征。壞死小體主要由受體相互作用蛋白激酶1和3(Receptor-interacting protein kinases 1/3,RIPK1/RIPK3)組成,RIPK1蛋白在人類疾病中發揮重要作用,有報道發現RIPK1基因突變導致單基因遺傳的自身炎癥性疾病。攜帶RIPK1突變的患者會發生反復感染、早發性炎癥性腸病等,正?;蛐偷脑煅杉毎浦部梢跃徑饣颊叩难装Y表現。最新報道還發現攜帶RIPK1切割位點變異會導致患者早發周期性發熱癥和嚴重的淋巴細胞增生疾病。RIPK1與RIPK3通過蛋白C端功能域RIP homotypic interaction motifs (RHIM)形成同源或異源多聚蛋白復合體。而目前對于保守的VQIG氨基酸序列組成的RIPK3蛋白C端RHIM結構域的生理功能及作用機制的研究仍不清楚。

  研究人員首先在體外細胞表達實驗中發現,人源和鼠源的RIPK3蛋白呈現多聚體狀態并且誘導細胞發生細胞凋亡。通過CRISPR-Cas9敲除RIPK1、FADD、Casp3就能阻止過表達RIPK3引起的細胞凋亡。此外通過突變RHIM功能域上的重要位點,發現人源V460P、鼠源V448P不僅阻止RIPK3蛋白多聚體的出現也可以阻止細胞凋亡的發生。因此,體外實驗結果表明人源V460P、鼠源V448P都可以破壞RHIM介導的RIPK3多聚引起細胞凋亡的功能。

  為了研究RIPK3蛋白RHIM功能結構域的體內功能,研究人員通過CRISPR-Cas9構建V448P點突變knock-in小鼠。對小鼠原代細胞進行細胞死亡誘導發現,V448P點突變細胞對RIPK1激酶依賴的細胞凋亡及細胞壞死都具有明顯的抵抗作用。免疫共沉淀實驗也顯示,V448P點突變后的RIPK3蛋白不能與RIPK1發生相互作用。為進一步證實V448P點突變抑制細胞壞死的作用,研究人員在FADD基因敲除小鼠中引入該突變,由于FADD敲除小鼠在胚胎發育時期由于發生過度細胞程序性壞死導致胚胎死亡,V448P點突變可以挽救FADD敲除導致的小鼠胚胎致死并存活到成年。這些實驗結果在體外、體內條件下均證實了RIPK3蛋白RHIM功能域在介導細胞死亡中的關鍵作用。

  人類自身免疫性淋巴細胞增生綜合征(autoimmune lymphoproliferative syndrome,ALPS)是一種淋巴細胞增生為特征的自身免疫性疾病。該疾病的發生是因為淋巴細胞的死亡通路被阻斷,導致淋巴細胞的發育穩態被破壞,表現為淋巴結腫大、脾臟腫大、淋巴瘤以及其它自身免疫性疾病的發生。研究人員發現FADD基因敲除小鼠中RIPK3基因V448P突變后小鼠表現為比RIPK3基因敲除更嚴重的系統性淋巴細胞增生疾病,而通過進一步敲除RIPK1則可以緩解這個疾病的發生。這一意外發現表明RIPK3的RHIM功能結構域不僅在介導細胞程序性壞死信號通路中具有關鍵作用,而且通過與RIPK1的相互作用在調控淋巴細胞發育及免疫穩態中也發揮重要作用,這些發現為治療與細胞死亡相關的自身免疫性疾病提供了理論基礎和新的靶點。

  營養與健康所研究員章海兵為該論文通訊作者,博士研究生張海威以及助理研究員吳小霞為共同第一作者。該工作得到上海交通大學醫學院瑞金醫院教授羅艷、上海交通大學醫學院公共衛生學院教授王慧、廣州醫科大學教授蔣義國等的大力支持。該研究還得到科技部、國家自然科學基金委及中科院等的資助,同時也得到營養與健康所公共技術平臺和動物平臺的支持。

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圖注: RIPK3 RHIM結構域調控細胞死亡與炎癥的作用機制

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